Detección y cuantificación de Mycoplasma hyopneumoniae en Cerdos adultos y Lechones

La capacidad de detectar al principal agente causante respiratorio porcino, Mycoplasma hyopneumoniae, a lo largo de las vías respiratorias es mayor cuanto más profundo es el lugar de la toma de muestras.

Mycoplasma hyopneumoniae es el agente principal del complejo respiratorio porcino (Thacker, 2006), una enfermedad responsable de importante pérdidas económicas en la producción porcina de todo el mundo (Aubry et al., 2010; Maes et al., 1999). La dinámica y la presión de infección de este microorganismo influyen en la aparición de la enfermedad (Fano et al., 2005; Fano et al., 2007; Sibila et al.,2004). El seguimiento de la contaminación de los animales proporciona información sobre la dinámica de la infección intraexplotación y permite investigar los factores asociados a los perfiles infecciosos. Seguidamente, pueden elaborarse programas de lucha y prevención adecuados partir de los resultados observados. Sin embargo, la determinación de la dinámica de infección depende de la disponibilidad de herramientas de diagnósticos y de unas técnicas de obtención de muestras y de análisis de laboratorio fiables, rápidas y fáciles de llevar a cabo por parte de los investigadores y de los veterinarios de campo.

En las explotaciones, la contaminación de los animales se suele evaluar mediante pruebas de PCR a partir de hisopos nasales. Sin embargo, los estudios experimentales indican que los puntos de extracción de muestras óptimos para detectar M.hyopneumoniae son las partes profundas de las vías respiratorias, es decir, la tráquea y los bronquios (Kurth et al.,2002;Marois et al.,2007). No están establecidas las características intrínsecas de las distintas técnicas de obtención de muestras para detectar M.hyopneumoniae en el cerdo vivo en condiciones de campo. Conocer estos elementos permitiría determinada la técnica de obtención de muestras más adecuadas para investigar el agente patógeno con fines de diagnóstico o investigación. Por otra parte, en el engorde casi nunca de ha plantado la cuantificación de M.hyopneumoniae.

Los objetivos de este trabajo son comparar cuatro técnicas de obtención de muestras: mediante hisopo nasal, hisopo orofaringeo, lavado traqueobronquial y sondaje traqueobronquial para detectar M.hyopneumoniae en cerdos vivos, además de cuantificar el microorganismo en distintos puntos del aparato respiratorio.


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Muestreo y análisis de laboratorio

El estudio se llevó a cabo en una explotación de maternidad y engorde afectada crónicamente por enfermedades respiratorias. Se obtuvieron muestras de un total de 60 cerdos escogidos aleatoriamente de una banda del final del engorde. Cada animal se sometió a cuatro extracciones de muestra: un hisopo orofaringeo, un sondaje traqueobronquial, un lavado traqueobronquial y un hisopo nasal (imágenes 1,2 y 3). Las muestras orofaríngeas se obtuvieron con un hisopo cuyo extremo era de tipo “cepillo”, provisto de una sonda de protección (Ori Endometrial Brush, Orifice Medical AB, Ystad, Suecia). Se introdujo la sonda por vía bucal y a continuación en la tráquea, en el momento en que el animal inspiraba. El lavado traqueobronquial se llevó a cabo mediante aspiración trans-traqueal de 10 ml de una solución de 0,1 M de PBS, NaCI 0,15 M. Mediante el hisopo nasal, se muestrearon las dos cavidades nasales con un hisopo (VWR international, Fontenay-sous-Bois, Francia). Cada muestra, excepto el líquido del lavado traqueobronquial, se introdujo en un tubo que contenía 2 ml de agua de peptona tamponada; todos los tubos se identificaron y transportaron al laboratorio. Todas las muestras se analizaron mediante PCR anidada (Calsamiglia et al., 1999b) y PCR cuantitativa a tiempo real (Marois et al.,2010).

Análisis estadísticos

Los resultados se sometieron a diferentes análisis estadísticos.

Estimación de las características de la técnicas de obtención de muestras

Las muestras se clasificaron en función de si el resultado de la PCR anidada era positivo o negativo. Dado que se desconocía el estado infeccioso de los animales y que no se disponía de ninguna prueba de referencia, se evaluó la sensibilidad de las técnicas de obtención de muestras aplicando un enfoque bayesiano (Berkvens et al., 2006).Este tipo de análisis permite evaluar las características de las pruebas de diagnóstico en función de los resultados del estudio y de los datos anteriores a la experiencia (denominados a priori) sin disponer de un método de referencia. En comparación con el enfoque clásico por frecuencias, en el análisis bayesiano los parámetros de interés son las variedades aleatorias y no las constantes. Estos parámetros poseen una distribución de probabilidad que es función de datos disponibles antes de la experiencia, denominados a priori, y por el teorema de Bayes se puede reducir una distribución de probabilidad a posteriori que tiene en cuenta datos anteriores a la experiencia y datos aportados por la experiencia. Las distribuciones de los parámetros se determinaron en base a datos externos anteriores al estudio (Calsamiglia et al., 1999a; Kurth et al., 2002; Marois et al 2007; Otagiri et al., 2005; Verdin et al., 2000).Dado que las muestras procedentes de cerdos EOPS (exentos de organismos patógenos) han arrojado un 100% de resultados negativos con independencia del método de obtención de la muestra, se ha establecido que la especificidad de cada método es 1 (Marois et al., 2010;Marois et al.,2007). La influencia de la elección de las distribuciones a priori sobre los resultados se evaluó comparando tres modelos, desde uno con, a priori, poco informativos (M1) a otro que comporta a priori más informativos (M3).Se evaluó la convergencia de modelos mediante las pruebas de Raftery y Lewis y la técnica de diagnosticó de GelmanRubin. Los modelos se compararon en base al criterio de información sobre la desviación, el número de parámetros estimados dentro del modelo y el valor del p-bayesiano. Los análisis se llevaron a cabo con el software WinBUGS.

Cuantificación de M.hyopneumoniae

Las cantidades medias de ADN de M.hyopneumoniae estimadas por RT-PCR se compararon entre métodos dos a dos mediante una prueba en dos partes adaptada a datos apareados no normales que presenta un exceso de cero (Lanchenbruch, 2001). Todas las comparaciones se llevaron a cabo con el software R (R Development Core Team, 2008).

Resultados

M.hyopneumoniae se detectó en un 13,3%,40%,53,3% y 60% de los cerdos en los que las muestras se obtuvieron mediante hisopo nasal, hisopo orofaríngeo, lavado traqueobronquial y sondaje traqueobronquial, respectivamente. En total, un 70% de los cerdos muestreados resultó positivo al menos en una técnica de obtención de muestras. En cualquier modelo, el hisopo nasal presentó la sensibilidad más fiable y el sondaje traqueobronquial, la más alta, con un 19% y un 74 % de sensibilidad, respectivamente (tabla).

Las cantidades medias de ADN de M.hyopneumoniae detectadas mediante hisopo nasal, hisopo orofaríngeo, lavado y sondaje traqueobronquial fueron de 7,0x10² fg/ml (desviación estándar=3,5x10³). 7,5x10(a la cuarta) fg/ml (desviación estándar =2.3x10 (a la quinta)), 4,0x10 (a la sexta) fg/ml (desviación estándar=1,7x10(a la séptima)) y 5,0x10(a la sexta) fg/ml (desviación estándar=1,9x10(a la séptima)), respectivamente. Se detectaron cantidades de ADN de M.hyopneumoniae significativamente más altas a partir de las muestras traqueobronquiales que de los hisopos de las vías respiratorias altas (p<0,001).No se observó ninguna diferencia significativa entre los resultados obtenidos por lavado y por sondaje traqueobronquial (p>0,05).Las cantidades medias obtenidas mediante hisopo nasal fueron significativamente más importantes que las detectadas por los otros métodos de obtención de muestras (p<0,001).

Discusión y conclusiones

Los resultados surgieren un aumento progresivo de la capacidad de detectar M.hyopneumoniae a lo lago de las vías respiratorias; la probabilidad de detectar el microorganismo en los cerdos infectados aumentaría con la profundidad de la toma de muestras. Estos resultados concuerdan con los obtenidos durante infecciones experimentales o naturales en engorde (Kurth et al., 2002; Marois et al., 2010; Marois et al., 2007; Verdin et al., 2000).El echo de que M.hyopneumoniae se detecta mejor a partir de la zona traqueobronquial se puede explicar por los puntos de adherencia y de multiplicación del microorganismo, que son las células epiteliales de la tráquea y los bronquios (Blanchard et al., 1992; Kurth et al., 2002; Marois et al., 2007). En cuanto a las técnicas de obtención de muestra a nivel traqueobronquial, (Marois et al., 2007) han indicado que la realización de lavados traqueobronquiales sucesivos sobre el mismo cerdo podría tener consecuencias en la gravedad de las lesiones pulmonares. Así, con el fin de reducir los efectos de la técnica de obtención de muestras sobre la apreciación de las lesiones pulmonares en el matadero, el método de elección debe ser el sondaje con una sonda estéril. En cuanto a las cuestiones prácticas, el sondaje traqueobronquial resulta tan fácil de llevar a cabo como la toma de muestras mediante hisopo nasal, y solo precisa un abrebocas como equipo complementado. Al ser 3,5 veces más sensible que el hisopado nasal, frecuentemente utilizando en el engorde, el sondaje traqueobronquial permite mejorar la precisión del diagóstico.

Fuente: Revista Albéitar & Razas Porcinas.


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