La criopreservación espermática del semen porcino

En este artículo se pretende analizar sucintamente la labor que un equipo de investigación multicéntrico está realizando, desde diversas perspectivas, en el campo del semen congelado en porcino.

La criopreservación espermática es una biotecnología de gran trascendencia, toda vez que tiene un papel relevante en la conservación y difusión de recursos genéticos.

Sin embargo, en la especie porcina no ha tenido éxito su utilización debido a la incapacidad de obtener resultados comparables a los del semen fresco o conservado mediante refrigeración a 15 ºC (Jonhson et al., 2000).

El uso de semen congelado en este sector representa apenas el 0,2% del total de inseminaciones realizadas en el mundo (gráfica); su utilidad ha quedado restringida puntualmente a la producción en pureza de núcleos de selección, bancos genéticos y transporte internacional (Almlid y Hofmo,1996), perdiéndose la gran disponibilidad espacio/temporal que ofrece el semen congelado.

Otras causas de la baja utilización del semen congelado porcino son:

• Alto coste, con un alto número de espermatozoides por dosis y un manejo complicado (Bolarin et al., 2006).
• Excesiva variabilidad de la congelabilidad entre razas, individuos y eyaculados.
• Imprecisión de los criterios de valoración del semen criopreservado en relación a su fertilidad.
• Precapacitación y disminución de la vida útil espermática.
• Celo excesivamente largo de la cerda y periodo prolongado de ovulaciones.

A pesar de este panorama desalentador, la investigación en el campo de la crioconservación del semen porcino no ha cesado, intentando mejorar los resultados de fertilidad y prolificidad.

Nuestro grupo de investigación aborda, entre otros, los siguientes aspectos: la optimización de los protocolos de congelación; la mejora de la calidad seminal y capacidad fecundante mediante diversas técnicas (aditivos, antioxidantes, plasma seminal, etc.); el desarrollo de test de criorresistencia y termorresistencia espermática que predigan la congelabilidad; el estudio y evaluación objetiva de las lesiones de capacidad funcional espermática mediante técnicas de visión artificial (sistemas CASA-ASMA) y la inducción y sincronización de ovulaciones tras el destete de la cerda.

A continuación se describen los cinco efectos de la criopreservación sobre la funcionalidad y estructura espermática.Efectos de la criopreservación sobre la funcionalidad y estructura espermática

Alteraciones en las membranas celulares

El plasmalema (membrana plasmática) es la estructura espermática (figura 1) que resulta más severamente dañada (Parks, 1997), aunque la membrana acrosómica externa y las membranas de la mitocondria también se ven afectadas (Watson, 1995).

Estas alteraciones estructurales provocan pérdida de enzimas intracelulares y trastornos en el balance iónico, con pérdida de la permeabilidad selectiva del plasmalema y trastornos en el metabolismo aeróbico y glucolisis anaeróbica, comprometiendo todas aquellas funciones celulares energético-dependientes, como la motilidad; de igual forma se produce pérdida de enzimas responsables de la metabolización de las ROS (Reactive Oxigen Species) y la disminución de compuestos antioxidantes (alfa-tocoferol, ácido ascórbico, taurina, hipotaurina, etc.) en el medio extracelular tras la dilución y/o centrifugación previa a la congelación (Brouwers et al. 2005).

Modificaciones del medio interno

Se producen alteraciones en el balance iónico del sodio, zinc y calcio, que se acumulan en el espacio intracelular, y del potasio y magnesio, que salen masivamente de la célula (Watson y Plummer, 1985).

Aunque existen grandes diferencias individuales, el incremento de calcio intracelular es muy característico de la especie porcina en comparación con otras especies, y se debe a una alteración de la bomba que lo regula (White, 1993), ya que las proteínas de membrana que funcionan como bomba de iones disminuyen su actividad con el descenso de la temperatura (Watson y Plummer, 1985).

Efectos sobre el citoesqueleto

Muchas de las proteínas del citoesqueleto ejercen una función estabilizadora del plasmalema (Holt y North, 1991), con un comportamiento de despolimerización y repolimerización dependiente de la temperatura (Watson, 1995).

El glicerol, además, altera a los microtúbulos, lo que repercute indirectamente sobre la membrana. Por otro lado, los rápidos cambios del volumen celular influyen sobre el sostén esquelético de las membranas plasmática y acrosomal, aunque poco se conoce al respecto (Watson, 1995).

En la alteración estructural de la membrana plasmática de la región acrosómica influyen las dimensiones de la cabeza espermática: en el espermatozoide de las especies más vulnerables ésta es alargada y plana, distinta de la más pequeña y convexa de las especies resistentes.

El componente citoesquelético estabilizador parece no estar presente en la región anterior de la cabeza, con lo que las consecuencias del enfriamiento serían más graves en las especies con espermatozoides de cabeza plana y alargada (Watson y Plummer, 1985).

Congelación del semen porcino

La tecnología de crioconservación incluye seis etapas importantes:

1. Dilución seminal.
2. Enfriamiento de la suspensión espermática.
3. Adición del agente crioprotector y envasado.
4. Congelación.
5. Almacenamiento en envase criogénico.
6. Descongelación y aplicación a la hembra.

El diseño de cada una de estas fases debe ir enfocado a producir el menor daño posible sobre las estructuras y el metabolismo del espermatozoide, siendo de especial importancia la función y arquitectura de la membrana plasmática.

La inadecuada adaptación a las etapas citadas anteriormente, así como los cambios que va a sufrir la célula durante tan delicado proceso, son responsables de daños o agresiones, que suponen la pérdida de la capacidad del espermatozoide para llevar a cabo sus funciones con normalidad (Watson, 1995; Gao et al., 1997).

No obstante, se considera que la adición del agente crioprotector (Watson, 2001) y las etapas de enfriamiento, congelación y descongelación (Watson, 1990) son las principales fuentes de daño sobre las células en el conjunto del proceso.

De todos los protocolos descritos de congelación, sólo han sido utilizados intensamente a nivel comercial los de Pursel y Johnson, y de Westendorf et al. (Johnson, 1985). De 1985 a esta parte se ha de-sarrollado un gran trabajo experimental para establecer las condiciones óptimas de congelación y descongelación y hacer más práctico el uso de semen, pero siempre tomando como base los dos protocolos anteriormente citados.

El protocolo de congelación utilizado por nuestro equipo de investigación es el denominado optimizado de Bwanga et al. (1990), basado en los siguientes pasos:

• Concentración seminal por centrifugación.
• Diluyente de refrigeración con yema de huevo.
• Diluyente de congelación con glicerol.
• Envasado en minipajuelas de 0,25 ml.
• Régimen trifásico de congelación desde 6 ºC hasta –100 ºC, utilizando un congelador de N<sub2< sub=””> líquido programable con control del descenso de temperatura.

Efectos sobre la movilidad

Tal como ha señadado Brouwers et al. (2005), la peroxidación lipídica es particularmente intensa en la pieza intermedia, lo que explicaría la disminución de la movilidad espermática tras la descongelación.
Los cambios cualitativos de la movilidad después de la descongelación (Cremades et al., 2005), presentan similares características a los espermatozoides hiperactivados a consecuencia de la capacitación espermática previa a la fecundación (Schmidt y Kamp, 2004).

Efectos sobre el núcleo

El fenómeno de supercondensación de la cromatina nuclear se ha constatado en espermatozoides criopreservados de verraco (Hamamah et al., 1990), relacionándolo con una alteración de la capacidad fecundante y del desarrollo embrionario.

También Martín-Rillo et al. (1999) asocian los trastornos del desarrollo embrionario a alteraciones en la organización de la cromatina nuclear, pues encuentran una mayor proporción de embriones en estadios menos avanzados del desarrollo, y también de embriones degenerados en cerdas inseminadas con semen descongelado, en comparación con otras que lo fueron con refrigerado.
Un estudio de Fraser y Strzezek (2007) ha descrito un incremento de la fragmentación del ADN del núcleo de los espermatozoides porcinos tras el proceso de congelación-descongelación.

Aportaciones a la criopreservación espermática

Nuestras aportaciones a esta línea de investigación han sido numerosas y en diferentes aspectos, que resumidamente podemos agrupar en las siguientes:

1. Criorresistencia y termorresistencia como pruebas de la valoración de la capacidad de criopreservación.
2. Lesiones espermáticas durante la criopreservación y vitalidad espermática. Utilización de antioxidantes en su prevención.
3. Aplicaciones de las nuevas tecnologías CASA y ASMA en la cuantificación de lesiones espermáticas durante la criopreservación: desarrollo de nuevas técnicas de visión artificial en la valoración de las lesiones acrosomales producidas durante la criopreservación.
4. Utilización del test homólogo FIV en la valoración de la capacidad fecundante del semen descongelado de verraco.
5. Variación de las subpoblaciones espermáticas durante el proceso de congelación-descongelación.
6. Protocolos de inducción y sincronización del celo en la cerda en la ayuda al proceso de inseminación con semen criopreservado.

La valoración de la criorresistencia de un eyaculado depende del parámetro de medida de calidad que se considere (Peláez, 2003; Peláez et al., 2004).

En nuestro trabajo la estimación más precisa se obtiene considerando el porcentaje de espermatozoides mótiles bajo estimulación con cafeína y el porcentaje de espermatozoides con membrana plasmática íntegra evaluada con el fluorocromo yoduro de propidio.

No obstante, la utilización de una prueba complementaria de termorresistencia posdescongelación, mediante incubación a 37 ºC, con un seguimiento de la motilidad espermática (mejor que de la vitalidad) con y sin estimulación por cafeína, tiene mayor capacidad discriminativa y contribuye a una valoración más acertada de la criorresistencia.

Una sencilla prueba de termorresistencia es un test interesante, toda vez que demuestra cómo el porcentaje de espermatozoides vivos y/o mótiles se reduce considerablemente a las 2-3 h de incubación, con dificultades en muchos casos para el mantenimiento de la vitalidad y/o motilidad espermáticas desde los primeros 15 minutos.

También hemos demostrado (Peláez et al., 2006) cómo el proceso de criopreservación merma considerablemente la capacidad fecundante de los espermatozoides, posiblemente provocada, entre otros factores, por una tendencia extremadamente acelerada a experimentar el fenómeno de capacitación con reducción de sus posibilidades de supervivencia.

Por ello, la adición de plasma seminal en el momento de la descongelación del semen que detenga el proceso de capacitación hacia el que lleva la criopreservación es también una buena línea de investigación que estamos llevando a cabo (Abad, M. et al., 2006).

En estos momentos trabajamos en un proyecto que valore la capacidad de criorresistencia sin tener que realizar la congelación: es una prueba también basada en la termorresistencia y otra basada en la inducción de un shock a frigore del eyaculado recién recolectado y simplemente diluido.

Esperamos así predecir la capacidad de criorresistencia de los eyaculados, de manera que solamente se procediera a la congelación en aquellos que merezcan la pena, según su fertilidad posterior.

Otra faceta interesante de nuestras investigaciones es la evaluación de los fenómenos acaecidos durante el proceso de congelación-descongelación mediante la tecnología de análisis computarizado digital de imágenes (figura 2), que presenta numerosas ventajas, tales como la objetividad, la individualización de cada una de las células espermáticas valoradas y la determinación de parámetros que por técnicas tradicionales sería imposible de realizar.

Hemos podido comprobar que todos los cambios morfométricos observados con motivo de la criopreservación espermática de verraco tienen lugar en la etapa comprendida entre la adición del agente crioprotector y la descongelación; todos ellos derivan de una reducción significativa del eje longitudinal de la cabeza del espermatozoide, con una distribución subpoblacional que varía a lo largo del proceso de congelación-descongelación, constatándose un incremento de los espermatozoides móviles con características próximas a la hiperactivación desde la recogida seminal hasta el final de la incubación a 5 ºC en el proceso de congelación, mientras que después de la descongelación son mayoritarias las células espermáticas que describen trayectorias más lineales y regulares, con una velocidad lineal más alta (Tejerina et al., 2005, 2006, Tejerina, 2008).