La importancia de la elección de un diluyente de semen es crucial en las condiciones de producción actual y apuntar hacia dónde van dirigidas las investigaciones para su aplicación es el futuro. La elección del diluyente debe ir asociada al tipo de uso que se vaya a hacer de él.
Cuando el tiempo de conservación sea inferior a tres días, la elección más racional sería la utilización de un diluyente de corta duración con unos costes menores y con unos resultados equivalentes a los de diluyentes de larga duración. Cuando lo que se pretende es conservar dosis seminales más allá de 4 días (largas distancias, evaluaciones sanitarias del semen, etc) se deben utilizar diluyentes de larga duración y aumentar la concentración de la dosis para compensar las pérdidas por envejecimiento de los espermatozoides.
En cualquier caso la elección del diluyente debe realizarse con el objetivo de optimizar los resultados de fertilidad y prolificidad en las condiciones particulares de cada explotación porcina, ya que su repercusión en el rendimiento económico de la explotación es crucial.
Un poco de historia en la inseminación artificial porcina
La inseminación artificial porcina (IA) fue iniciada por Ivanow en Rusia en los primeros años del siglo XX (Ivanow, 1907 y 1922). Posteriormente, se desarrolló su uso en la década de los 30 en las granjas estatales rusas (Rodin y Lipatov, 1935; Milovanow, 1938) y en los años siguientes se fue extendiendo a otros países (en USA Mckenzie, 1931; en Japón, Ito et al., 1948). Esta técnica fue reintroducida en el sector porcino en el Reino Unido gracias a los trabajos desarrollados por Chris Polge (1956), ya que la gran ventaja que aportaba esta tecnología era el aprovechamiento del potencial genético de los mejores verracos en un amplio número de cerdas reproductoras, facilitando la mejora genética.
Pero el verdadero desarrollo y la amplia aplicación a nivel comercial de la inseminación artificial porcina se produce a partir de la década de los 80 (revisado por Reed, 1985; Crabo, 1990; Johnson et al. 2000), cuando se estandarizan los protocolos de inseminación. Obviamente en esta evolución de prácticamente un siglo se han desarrollado sistemas de recogida y preparación de dosis, así como se han mejorado todos los protocolos de inseminación en condiciones comerciales.
En la actualidad, la inseminación artificial porcina es una técnica reproductiva de amplia aplicación en todo el mundo, aunque el grado de utilización en los diversos países es muy variable. En los países europeos en general la aplicación de la inseminación artificial es muy elevada, llegando a tasas superiores al 80% en algunos países (Holanda, Francia, Alemania, España, Noruega, Finlandia, etc.), mientras que, por el contrario, en los Estados Unidos el porcentaje de utilización de la inseminación artificial es aún reducido (del orden del 50%), aunque en los últimos años se ha producido un incremento muy destacable. Según las últimas estimaciones en el mundo se realizan unas 19 millones de inseminaciones, de las cuales la práctica totalidad (99%) se realiza con semen refrigerado a 15º – 20º C (Johnson et al., 2000). De estas inseminaciones más del 85% se realiza en el mismo día de recogida o en el día siguiente. Entre los factores que han favorecido el desarrollo de esta técnica se encuentran las ventajas en la diseminación del material genético mejorante del verraco, unido a que los resultados obtenidos con esta técnica igualan, incluso mejoran, los obtenidos en sistemas con monta natural.
De todos los factores que intervienen en el proceso de inseminación artificial porcina nos centraremos en este artículo en el análisis de la importancia económica y productiva de los diluyentes de inseminación artificial porcina. A pesar de la importancia de este factor, no hay en la literatura científica un gran número de revisiones que analicen este punto (Weitze, 1990; Reed, 1990; Althouse, 1997; Johnson, 2000; Levis, 2000), por ello nuestro objetivo es revisar a la luz de los últimos trabajos publicados la importancia de la elección del diluyente de inseminación artificial porcina en las condiciones de producción actual.
Diluyente
Por diluyente entendemos la solución acuosa que permite aumentar el volumen del eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias y preservar las características funcionales de las células espermáticas y mantener el nivel de fertilidad adecuado.
Los espermatozoides se encuentran en el plasma seminal que suministra los nutrientes necesarios para mantener una elevada actividad metabólica requerida para el proceso de transporte espermático a través del genital femenino. En el eyaculado, esta actividad metabólica solo puede mantenerse durante un período de tiempo muy limitado, como es conocido desde los primeros estudios sobre la conservación del semen porcino (Lewis, 1911). Para poder conservar los espermatozoides durante períodos prolongados es necesario que se reduzca la actividad metabólica de los espermatozoides, mediante la dilución en un medio adecuado y la reducción de la temperatura.
Las peculiares particularidades que presenta el espermatozoide porcino hace que sea muy sensible al shock por frío (Pursel et al., 1973a), que produce una alteración de la viabilidad espermática. En concreto la composición lipídica de sus membranas parece ser la responsable de esta situación. Así, cuando se reduce la temperatura los movimientos laterales de los fosfolípidos que componen la membrana se ven reducidos y se producen separaciones de fases lipídicas, situación asociada a alteraciones irreversibles de las proteínas de las membranas. Todo hace que se altere la funcionalidad de la membrana espermática y la viabilidad celular se vea comprometida (revisado por White, 1993). Esta susceptibilidad al choque por frío, supone en la práctica que las muestras seminales deban ser conservadas a 15º – 20º C, ya que una reducción en la temperatura de almacenamiento limita la viabilidad de las muestras seminales (Paulenz et al., 2000).
La conservación a estas temperaturas moderadamente reducidas limita la capacidad de almacenamiento de las muestras por una parte porque no puede reducirse el metabolismo celular y por otra porque no pueden controlarse las condiciones microbiológicas con la misma efectividad de temperaturas inferiores (5º C).
Por otra lado, el efecto de dilución lleva a que determinados compuestos presentes en el plasma seminal estén en muy bajas concentraciones en el semen diluido y alteren la viabilidad espermática, como por ejemplo la reducción de la concentración de K+ (Harrison et al., 1978), o de proteínas plasmáticas. Estas pérdidas deben compensarse con la adecuada formulación del diluyente, así por ejemplo la adición de albúmina sérica bovina (BSA), ya que se ha demostrado que esta adición estimula la motilidad (Waberski et al. 1989) y mejora las tasas de fertilidad del semen conservado (Waberski et al., 1994).
Tipos de diluyentes
A nivel práctico en las condiciones actuales de producción los diluyentes se han clasificado en dos grandes grupos, los que tienen como objetivo la conservación a corto plazo (menos de 1 a 3 días), o aquellos que tienen por objetivo la conservación a largo plazo (más de 4 días) (Ver Tabla 1).
Los diluyentes de corta duración se utilizan principalmente en estructuras de distribución de las dosis seminales a corta distancia (propias de los sistemas europeos, donde la producción de dosis seminales en la misma granja es frecuente) mientras que los diluyentes de largo plazo son propios de estructuras como las presentes en USA o Noruega donde las distancia entre el lugar de producción seminal y el lugar donde va a ser utilizado es grande.
Tabla 1. Marcas de diluyentes agrupados por la duración
| Corta duración (1 – 3 días) | Larga duración (más de 4 días) |
|---|---|
Beltsville Liquid (BL-1) | Acromax® |
Beltsville Thawing Solution (BTS) | Androhep® |
Illinois Variable Temperature (IVT) | Modena |
Kiev | MULBERRY III® |
Reading | |
X-Cell® | |
Zorlesco | |
ZORPVA |
Las ventajas que aportan los diluyentes de larga duración son la posibilidad de transporte a largas distancias, permiten realizar pruebas diagnósticas sobre el semen antes de ser utilizados, como pruebas mediante técnicas para detectar la presencia de diversos virus o análisis completos de la calidad seminal, permitiendo una mejor organización de las tareas en los centros de recogida seminal y facilitando en gran medida la distribución de las muestras a las granjas de reproducción.
Los primeros diluyentes rusos estaban basados en soluciones de glucosa con tartrato de sodio o potasio o sulfato sódico y peptonas, manteniendo en cualquier caso bajos niveles de electrolitos (revisado por Foote, 2002). Posteriormente en la década de los 50, se produjo el desarrollo de los diluyentes para el ganado bovino, basados en yema de huevo con fosfato o citrato y leche, y se hicieron algunas adaptaciones para conservar semen porcino (revisado por Foote, 2002). De entre todos, cabe destacar la adaptación del diluyente Illinois Variable Temperature que se utilizaba para la conservación de semen en el ganado vacuno a temperatura ambiente (du Mesnil du Buisson y Dauzier, 1959). Este IVT medio está basado en una solución de glucosa, citrato, bicarbonato y yema de huevo, pero necesitaba ser gaseado con CO2 para reducir la actividad metabólica (Ver Tabla 2).
Tabla 2. Composición (en g/L) de los diluyentes de inseminación artificial porcina más utilizados
IVT | Kiev | BTS | Zorlesco | MRA | ZORPVA | Reading | Modena | Androhep | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Glucosa | 3 | 60 | 37 | 11.5 | + | 11.5 | 11.5 | 25ª | 26 |
| Citrato sódico | 24.3 | 3.7 | 6.0 | 11.7 | + | 11.65 | 11.65 | 6.90 | 8.0 |
| EDTA | 3.7 | 1.25 | 2.3 | + | 2.35 | 2.35 | 2.25 | 2.4 | |
| Bicarbonato sódico | 2.4 | 1.2 | 1.25 | 1.25 | + | 1.75 | 1.75 | 1.00 | 1.2 |
| Cloruro potásico | 0.4 | 0.75 | – | ||||||
Acetilcisteina | 0.05 | ||||||||
| HEPES | 9.0 | ||||||||
| BSA | 5.0 | + | 3.00 | 2.5 | |||||
| TRIS | 6.5 | – | 5.5 | 5.5 | 5.65 | ||||
| Ácido cítrico | 4.1 | – | 4.1 | 4.1 | 2.00 | ||||
| Cisteina | 0.1 | + | 0.7 | 0.7 | 0.05 | ||||
| Trehalosa | 1 | ||||||||
| PVA | 1 | 1 | |||||||
| Acetato potásico | + | ||||||||
| MOPS | + | ||||||||
mOsm | 290 | 380 | 330 | 240 | 290 | 275 | 300 | 282 | 309 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 6.9 | 6.9 | 6.8 |
En la década de los 60, se produce una gran innovación consistente en la adición de un agente quelante (EDTA), que permitiría bloquear la acción del calcio como mediador de los procesos de capacitación y reacción acrosómica. Es cuando aparece el diluyente Kiev (Plisko, 1965) que posteriormente ha sido modificado y recibido otras denominaciones (EDTA, Merck I, Plisko, Guelph). Este medio Kiev permitió una amplia difusión de la inseminación artificial porcina y todavía sigue utilizándose con éxito en nuestros días.
En la década de los 70, destaca la ingente labor que se realiza en el centro Beltsville (USA) acerca del estudio de las posibilidades de conservación de los espermatozoides porcinos. Bajo la dirección de Pursel y Johnson se realizan un gran numero de ensayos para poner a punto diluyentes para refrigeración (BL-1, Pursel et al., 1973b) y congelación (BF-5, Pursel y Johnson, 1975), pero sin duda la mayor difusión la alcanzan con el medio BTS (Betsville Thawing Solution, Pursel and Johnson, 1975) diseñado en un principio como medio de descongelación y que fue adaptado al semen refrigerado (Johnson et al., 1988). Probablemente el BTS sea el más usado en la actualidad en todo el mundo. Este medio se caracteriza por añadir una pequeña cantidad de potasio, que permite mantener la actividad de la bomba sodio potasio y evita la reducción de potasio intracelular que estaría asociada con la disminución de la motilidad (Alvarez y Storey, 1982).
El primero de los diluyentes de los denominados de larga duración fue el Zorlesco (Gottardi et al., 1980), que se caracteriza por ser un medio bastante más complejo, con la adición de TRIS como regulador del pH, albúmina sérica bovina (BSA) y cisteína en su composición. Esta cisteína (como otros compuestos con grupos sulfhidrilo) permitiría estabilizar las membranas e inhibir el proceso de capacitación (Johnson et al., 2000). La utilización de este diluyente en condiciones de campo no produjo unos resultados satisfactorios, en parte debido a desequilibrios en su composición que suponen una presión osmótica final reducida (240 mOsm, tabla 2). Posteriormente, Moretti (1981) crea el diluyente Modena, incrementando la proporción de glucosa y eliminando la BSA del medio Zorlesco, pero los resultados de fertilidad obtenidos tampoco son satisfactorios (Johnson et al., 1988; Laforest y Allard, 1996).
Por otra parte, en España, Santiago Martín Rillo y Eulogio Alias desarrollan el medio MR-A (Martín Rillo, 1984) y aunque no se ha hecho pública su composición cuantitativa (protegida por razones comerciales) si la cualitativa. Este medio ha dado muy buenos resultados como diluyente de larga duración.
En esta misma época se diseñaron dos diluyentes de larga duración en el Reino Unido, ZORPVA (Cheng, 1985) y Reading (Revell y Gossop, 1989). Estos son medios complejos basados en el medio Zorlesco ligeramente modificado y al que se le añade alcohol de polivinilo como macromolécula (PVA) con lo que mejora el porcentaje de acrosomas intactos. Estos diluyentes suponen un coste superior (149 – 163%, Reed y Curnock, 1990) a los diluyentes de corta duración y con unos resultados no superiores a los obtenidos con otros diluyentes (Reed y Curnock, 1990), por lo que realmente no se ha extendido su uso.
En 1990 Wietze presenta el diluyente Androhep, que se caracteriza por contener HEPES como regulador del pH, la adición de BSA, para compensar el efecto dilución de las proteínas del plasma seminal y por presentar una presión ligeramente hipertónica (309 mOsm). Este diluyente ha tenido una importante aceptación en el sector como diluyente de larga conservación.
En los últimos años han aparecido nuevos diluyentes (Acromax, X-Cell, Androhep Plus, Vital, SpermAid, Mulberry III, etc) que se encuadran dentro del grupo de larga duración. Lamentablemente, la composición cuantitativa de estos medios no es conocida, ya que está protegida por razones comerciales y, aunque no dudamos de las bondades de estos diluyentes, hasta el momento se dispone de escasa información de los resultados de fertilidad en estudios comparativos realizados por centros independientes, por tanto deberemos esperar hasta que esta información se haga pública.
En cuanto a los diluyentes empleados en los procesos de congelación del semen porcino hemos de decir que están basado es en la utilización de la yema de huevo y glicerol como agentes crioprotectores, una concentración elevada de azucares y la adición de un agente detergente (Orvus et paste). De los diluyentes utilizados destacamos el medio lactosa-yema de huevo que es el más frecuentemente empleado y el descrito por Pursel y Johnson (1975) denominado BF-5, en cuya composición se incluye glucosa, yema de huevo y Tris como agente regulador del pH, que se utiliza en los procesos de congelación en píldoras (pellets) sobre nieve carbónica.
Funciones del diluyente
Para llevar a cabo su misión el diluyente debe aportar los nutrientes necesarios para el mantenimiento metabólico de la célula espermática (glucosa), la protección frente al shock térmico por frío (BSA), controlar el pH del medio (Bicarbonato, TRIS, HEPES), la presión osmótica (sales NaCl, KCl) y la inhibición del desarrollo microbiano (antibióticos).
Nutrientes
El espermatozoide tiene capacidad de producir la energía necesaria para mantener su metabolismo celular y generar el movimiento del flagelo, principalmente a través de las vías glicolíticas. Estos procesos se desarrollan en las mitocondrias localizadas en la porción intermedia del espermatozoide. La fuente de energía más frecuentemente utilizada en la composición de los diluyentes es la glucosa, aunque se han usado otras (galactosa, fructosa, ribosa o trehalosa) sin que los resultados hayan superado a la glucosa.
Regulación del pH
El pH del semen recién eyaculado se encuentra próximo a 7.4 ±0.2, al igual que otros fluidos orgánicos, y cuando se reduce este pH al mismo tiempo se reduce el metabolismo energético del espermatozoide y su motilidad. El metabolismo glicolítico que desarrolla el espermatozoide (carbohidrato principal es glucosa) hace que el pH intracelular disminuya y el metabolismo celular quede reducido. El ácido láctico es el principal metabolito de este proceso y ha sido utilizado como indice de calidad seminal (Rigau et al., 1996).
La adición de agentes tamponadores ayudan, por tanto, a controlar el pH del medio. Entre los tamponadores más simples se encuentran el bicarbonato y el citrato (sódico) que presentan una capacidad de tamponar limitada, mientras que otros tamponadores más complejos (TES, HEPES, MOPS, TRIS) pueden regular el pH en un rango más amplio y no son dependientes de la temperatura (MOPS y HEPES).
El pH de los diluyentes normalmente utilizados oscila entre 6.8 y 7.2 (Ver Tabla 2), pero hemos de tener en consideración que el pH de estos medios no se estabiliza hasta pasado unos 60-90 minutos del inicio de la dilución en agua y que los distintos diluyentes presentan un diferente patrón de cambio de su pH a lo largo del tiempo (Newth y Levis, 1999). Por lo que se han de tomar las medidas oportunas en el proceso de preparación de los diluyentes antes de su uso, para evitar problemas en el proceso de conservación.
Presión osmótica
El espermatozoide porcino presenta una presión osmotica de 290-300 mOsm, y es capaz de tolerar un rango de presiones osmóticas bastante amplio (240-380 mOsM). Diversos estudios han evaluado la tolerancia a diversas presiones osmóticas, llegando a la conclusión que ni la motilidad ni la viabilidad espermática se ve afectada por la presión osmótica en rangos comprendidos entre 250 y 290 mOsm (Fraser et al., 2001), mientras que cuando se reduce por debajo de 200 mOsm se detecta una reducción significativa de la motilidad (Gilmore et al., 1996, Fraser et al., 2001).
En cualquier caso, los diluyentes isotónicos (300 mOsm) o ligeramente hipertónicos son los que mejores resultados han dado en condiciones de utilización comercial. Para regular la presión osmótica se utiliza principalmente sales de iones inorgánicos como el cloruro sódico y potásico.
Coste del diluyente
En general, los gastos reproductivos suponen una baja proporción en relación con el total del proceso de producción porcina, de tal manera que su peso económico ha sido estimado en un 1.9% (Rouco y Muñoz, 1998). Si consideramos que en este gasto reproductivo la mayor parte está asociado a los recursos humanos necesarios para el diagnóstico del estro, la recogida seminal y la administración de la dosis seminal (Flowers y Esbenshade, 1993; See, 1996), el diluyente por tanto supone muy poco dinero del total de gastos de una explotación porcina. Sin embargo, el diluyente si puede ser una decisión económica de interés, en el caso de los centros de inseminación artificial cuyo cometido es la venta de dosis seminales. En cualquier caso el coste del diluyente es una cuestión ridícula frente a las consecuencias que puede suponer en los rendimientos de fertilidad y prolificidad.
En el concepto de coste del diluyente debemos incluir no sólo el destinado a la adquisición de los componentes del diluyente sino también el que supone su preparación. Por ello en los últimos años, y debido al elevado coste del personal, se opta por la adquisición de medio preparados en polvo (incluso en soluciones stock líquidas) que únicamente necesitan de la dilución con agua destilada, frente a la alternativa de la elaboración propia que implica el pesado de cada uno de los componentes y la dilución final.
Al mismo tiempo, se han creado un gran número de empresas dedicadas al diseño y producción de diluyentes que han facilitado una amplia oferta y han desarrollado un sector con una importante actividad comercial y económica (Pig International, 1998) en la que hay una gran competencia entre los distribuidores. En cualquier caso, y de forma general, los diluyentes de larga duración son más caros que los de corta duración, debido a la adición de componentes de alto precio como el TRIS, BSA, etc, y a que necesitan un mayor tiempo de pesado en su elaboración al ser un medio complejo con mayor número de componentes (Reed, 1990).
Utilización de antibióticos
En la mayoría de los casos el tejido testicular y las glándulas accesorias del verraco están libres de bacterias y por tanto la contaminación bacteriana del eyaculado se produce durante el proceso de recogida seminal (Martin Rillo et al., 1998). Para controlar el crecimiento microbiano en el diluyente es necesario añadir un agente antibiótico, ya que los componentes del diluyente (glucosa) así como la temperatura a las que se conservan las dosis (15-16ºC), permiten el crecimiento de la mayoría de bacterias gram negativas entre las que se incluyen (E. Coli, Salmonella y Pseudomonas).
La contaminación bacteriana principalmente produce una serie de alteraciones entre las que se encuentra una disminución de la motilidad, aglutinaciones espermáticas, aumento del porcentaje de acrosomas alterados y una reducción del pH hasta niveles ácidos (5.7-6.4) (Althouse et al., 2000), que conducen a una reducción en el tiempo de conservación de las dosis seminales. Por tanto, la adición del antibiótico en la adecuada concentración favorecerá la supervivencia espermática y se incrementarán los resultados de fertilidad (revisado por Colenbrander et al., 1993). Además de la aplicación del antibiótico adecuado en la concentración necesaria, se puede hacer un gran avance en este sentido si se mejoran las condiciones higiénicas en las que se produce la recogida seminal y el procesado de las dosis seminales (Almond and Poolperm, 1996).
La adición de penicilina y estreptomicina (1 g/L) fue en un principio la combinación más utilizada, posteriormente se han utilizado con éxito aminoglicósidos, entre los que se encuentra la gentamicina, neomicina y la kanamicina, en concentraciones próximas a los 200 mg/L. Últimamente, se está aplicando una nueva generación de antibióticos (ceftiofur, apramycina, etc), sin que tengamos aún resultados concluyentes sobre su uso.
A nivel normativo hay dos referencias fundamentales, la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) y la Unión Europea (UE).
La OIE regula, en su código internacional de sanidad animal (2001), las condiciones aplicables a los diluyentes. Básicamente aconseja que cuando en los diluyentes se encuentre como componente la leche, la yema de huevo o cualquier otra proteína de origen animal, estos productos deben estar libres de patógenos o esterilizados. Así mismo se permite la adición de antibióticos siempre que sean declarados en los certificados veterinarios internacionales.
Por otra parte, en el ámbito de la Unión Europea, la Directiva 90/429/CEE del Consejo, que regula las normas de policía sanitaria aplicables a los intercambios intracomunitarios y a las importaciones de esperma de animales de la especie porcina. Regula que se deberá utilizar una combinación de antibióticos, eficaces en particular contra los leptospiras y los micoplasmas. Dicha concentración deberá tener al menos un efecto equivalente a las concentraciones siguientes: mínimo: 500 UI de estreptomicina por mililitro, 500 UI de penicilina por mililitro, 150 mg de lincomicina por mililitro, 300 mg de espectinomicina por mililitro. En esta misma normativa se indica que inmediatamente después de añadir los antibióticos se deberá conservar el esperma diluido a una temperatura de al menos 15º C durante 45 minutos como mínimo.
Ensayos de fertilidad
Se han realizado un gran número de estudios que pretenden evaluar la eficiencia reproductiva que presenta la utilización de diversos diluyentes. Primeramente debemos considerar que la relación entre la calidad seminal (que preserva el diluyente) y la fertilidad resultante de su utilización no es directa (Gadea et al., 1998; Gadea, 2001). Además, estos estudios se han realizado en condiciones experimentales muy diferentes (tipo de animales, condiciones ambientales, nº de inseminaciones, nº de espermatozoides por dosis, momento de aplicación de las dosis, etc.) por lo que se debe tener especial cuidado en intentar hacer comparaciones entre ellos. Pretendemos en todo caso llegar a unas conclusiones generales aplicables a la mayor cantidad de casos.
Tiempo de conservación
Diversos estudios han analizado el efecto de la duración del almacenamiento en diversos diluyentes sobre la fertilidad resultante de su aplicación. Así, utilizando el diluyente BTS, Hofmo (1991) demuestra una reducción significativa de la fertilidad cuando se almacena 48 horas, mientras que el número de lechones nacidos totales (LNT) y nacidos vivos (LNV) decrece significativamente en 24 horas de conservación (Ver Tabla 3). Unos resultados similares fueron obtenidos por Alexopoulos et al. (1996) quienes detectan una reducción de la fertilidad cuando el semen es conservado más de 72 horas en BTS.
Tabla 3. Fertilidad y prolificidad tras inseminación con semen conservado en BTS
Horas conservación | Fertilidad (%) | LNT | LNV |
|---|---|---|---|
4-14 | 67.8ª | 11.96ª | 10.94ª |
28-38 | 69.8ª | 11.73b | 10.73b |
52-62 | 64.6b | 11.61b | 10.64b |
a,b: superíndices diferentes en la misma columna p<0.05
Fuente: Hofmo 1991.
Por otra parte, Martínez et al. (1986) demuestran que el diluyente MR-A es capaz de mantener la fertilidad y la prolificidad del semen conservado hasta un total de 5 días (Ver Tabla 4). Sin embargo, en otro estudio posterior se llega a la conclusión que la fertilidad decrece significativamente cuando se conserva en este medio 7-8 días (84 vs. 67.3 %) manteniendose similares los tamaños de camada (11.1 vs 10.7) (Lyczynski y Kolat, 1996).
Comparación entre diluyentes
Diversos trabajos se han realizado para evaluar en diferentes condiciones experimentales los nuevos diluyentes frente a otros conocidos. De entre todos los disponibles haremos relación a los más significativos.
Aunque se ha demostrado una mayor tasa de supervivencia espermática (medida con la motilidad) al utilizar diluyentes de larga duración (MR-A y Androhep) frente al diluyente de corta duración Kiev (Korniewicz et al., 1996), esta diferencia no fue significativa al comparar Androhep frente al BTS (Waberski et al., 1994a). Recientemente Huo et al. (2002) han presentado un interesante estudio sobre la calidad seminal en semen diluido en diversos medios (Androhep, Zorlesco, BTS y Kiev) hasta durante 15 días de conservación, mostrando que la viabilidad y actividad mitocondrial de los espermatozoides supera al 50% en el día 13 de conservación en los medios de larga conservación (Androhep y Zorlesco).
Tabla 4. Fertilidad y prolificidad tras inseminación con semen conservado en MR-A.
Días conservación | Nº cubriciones | Fertilidad (%) | LNT |
|---|---|---|---|
0-1 | 136 | 84.5 | 8.9 |
1-2 | 145 | 82.7 | 9.2 |
2-3 | 170 | 86.4 | 9.3 |
3-4 | 104 | 81.7 | 8.9 |
4-5 | 99 | 83.8 | 9.2 |
Fuente: Martínez et al. 1986.
Tabla 5. Fertilidad y prolificidad tras inseminación con semen conservado en Kiev o MR-A.
| Kiev | M-RA | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
Días | N | Fertilidad (%) | LNT | N | Fertilidad (%) | LNT |
1 | 20121 | 85.0 | 11.6 | 12556 | 85.6 | 11.9 |
2 | 14968 | 83.7 | 11.4 | 13139 | 84.7 | 11.8 |
3 | 2968 | 82.2 | 10.9 | 9110 | 82.6 | 11.5 |
4 | 294 | 82.3 | 10.5 | 4775 | 82.0 | 11.2 |
5 | 1747 | 80.4 | 10.8 | |||
6 | 706 | 81.5 | 11.2 | |||
7 | 183 | 81.4 | 10.4 | |||
Total | 38351 | 84.3 | 11.5 | 42216 | 84.0 | 11.6 |
Fuente: Ratto y Jokinen. 1990
El diluyente Kiev superó los resultados de fertilidad obtenidos por el Beltsville liquid I (BL1) conservado 1 (74.5 vs. 64.7%) o 3 días (65.9 vs 60.5 %) (Johnson et al. 1982). Posteriormente, dentro de los diluyentes de corta duración, el BTS aparece como superior en la fertilidad obtenida frente al Kiev, Zorlesco y Modena (Aalbers et al., 1983; Blichfeldt et al. 1988).
Al comparar diluyentes de corta frente al de larga duración, en general, no se observan diferencias ni en fertilidad ni prolificidad en los primeros 3-4 días de conservación, aunque el de larga duración permite su uso hasta 7 días (Ver Tabla 5) como los resultados obtenidos por Ratto y Jokinen (1990) al comparar Kiev y MR-A. Unos datos similares encuentran Johnson et al. (1988) al estudiar el diluyente BTS frente al medio MR-A y al Modena, no se encuentran diferencias entre el BTS y el MR-A hasta los 4 días de conservación, y se obtienen resultados significativamente mejores que para el Módena (Ver Tabla 6) en el caso de cerdas multíparas tanto para fertilidad como para el tamaño de camada. Sin embargo estas diferencias se reducen en el caso de cerdas primíparas, no existiendo diferencia alguna en el tamaño de camada entre los tres diluyentes estudiados. En el mismo sentido, Hofmo et al. (1998) no encuentra diferencias al utilizar BTS conservado durante 2-3 días frente MR-A durante 4-5 días.
Weitze (1990) al analizar la prolificidad del semen conservado 3 y 5 días en Androhep, BW25 y Kiev (Ver Tabla 7) no encuentra diferencia significativa alguna al estudiar la fertilidad. Este estudio se realizó con inseminaciones simples y 2 x 109 espermatozoides por dosis. Sólo se detecta una reducción de la prolificidad al aumentar el tiempo de conservación. Posteriormente, Waberski et al. (1994a) comparan los medios Kiev y Androhep conservados 2 a 5 días, con unos resultados similares en fertilidad, mientras que la prolificidad es superior para el Androhep a partir del cuarto día.
Tabla 6. Fertilidad y prolificidad tras inseminación con semen conservado en BTS, Modena o MR-A.
| Multíparas | Primíparas | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
BTS | Modena | MR-A | BTS | Modena | MR-A | |
| N | 721 | 700 | 720 | 103 | 117 | 91 |
| Fertilidad (%) | 79.3ª | 50.4b | 77.6ª | 73.5a | 50.2b | 64.1ab |
| LNT | 11.4ª | 10.0b | 11.1ª | 9.5a | 8.5a | 9.6ª |
| LNV | 10.7a | 9.4b | 10.5a | 8.9a | 7.8a | 9.0a |
a,b: superíndices diferentes en la misma columna p<0.004
Fuente: Johnson et al. 1988
Tabla 7. Fertilidad y prolificidad tras inseminación con semen conservado en 3 y 5 días Androhep, BW25 y Kiev
N | % Fertilidad | LNT | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
3 días | 5 días | 3 días | 5 días | 3 días | 5 días | |
| Androhep | 351 | 316 | 76.9 | 73.1 | 10.9a | 10.4b |
| BW25 | 361 | 357 | 76.7 | 67.2 | 10.8 | 10.2 |
| Kiev | 404 | 350 | 75.1 | 71.1 | 10.7a | 10.0b |
a,b: superíndices diferentes en la misma fila p<0.05
Fuente: Weitze, 1990.
Finalmente otros estudios han comparado diluyentes de larga duración entre sí. Laforest y Allard (1996) en Canadá al estudiar los diluyentes MRA, BTS, Modena y Androhep, no encuentran diferencias en fertilidad ni entre diluyentes ni en el tiempo de conservación (1-2 dias vs 3-4 dias). Sólo Modena presenta un número ligeramente reducido de lechones nacidos totales (LNT) a los 3-4 días. Por otra parte, Kuster y Althouse (1999) estudian el uso de Androhep y X-Cell, con unos resultados de en fertilidad similares entre ambos diluyentes y entre días de conservación (hasta el día 5). Sin embargo, en el día 6 de conservación Androhep presenta una menor fertilidad y en el día 5 una menor prolificidad. (Ver Tabla 8).
Tabla 8. Fertilidad y prolificidad tras inseminación con semen conservado en Androhep o X-Cell
| Androhep | X-Cell | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
Días | N | Fertilidad (%) | LNT | N | Fertilidad (%) | LNT |
2-3 | 170 | 85.9 | 10.3 | 172 | 86.1 | 10.2 |
3-4 | 164 | 86.6 | 9.2 | 151 | 84.1 | 10.0 |
4-5 | 188 | 85.1 | 9.0* | 183 | 86.3 | 10.4* |
5-6 | 201 | 78.6* | 9.4 | 202 | 85.6* | 9.7 |
* p<0.01
Fuente: Kuster y Althouse (1999)
Tendencias de futuro
Aunque ha transcurrido casi un siglo utilizando la inseminación artificial porcina, el conocimiento sobre los procesos de conservación de los espermatozoides porcinos es aún muy limitado, por lo que es necesario profundizar en los estudios en las siguientes direcciones:
- En el diseño de nuevos diluyentes. Hasta el momento se ha usado un modelo empírico, por lo que para el futuro es necesario conocer más a la célula espermática y su metabolismo, así como utilizar nuevos sistemas que permitan evaluar y optimizar los componentes del diluyente (Pettit et al., 1999). Del mismo modo, se están evaluando diversos aditivos que intervengan en la viabilidad de los espermatozoides (ej : alkil-glicerol; Cheminade et al., 2002), protejan del choque por frío (Zeng y Terada, 2001) o mejoren el transporte espermático, la sincronía con la ovulación (Waberski et al., 1994b) y el proceso de fecundación (revisado por Waberski, 1997; Kemp y Soede, 1997).
Conservación a temperaturas inferiores a los 15ºC actuales, que facilitarían el proceso de reducción de la actividad metabólica y los efectos perniciosos de la contaminación microbiana. Sin embargo debe solventarse el problema del choque térmico. En este sentido, diversos equipos están evaluando el efecto de la temperatura.
Fuente: Albéitar & Razas Porcinas.
