Las artritis infecciosas en ganado porcino normalmente tienen un origen sistémico y se manifiestan como poliartritis, produciendo un retraso en el crecimiento, obligando a eliminar animales de la explotación y provocando el decomiso de canales o de alguna de sus partes.
Entre los patógenos responsables de estos procesos se encuentran como principales agentes: Streptococcus suis, Streptococcus spp., Arcanobacterium pyogenes, Staphylococcus spp., Haemophilus parasuis, Erysipelothrix rhusiophatiae y Mycoplasma hyosinoviae (2, 3, 14). Aunque existen varios trabajos que describen la prevalencia de los diferentes patógenos en animales de matadero con artritis crónicas (3, 6, 16, 10), existen muy pocos estudios sobre los procesos clínicos agudos que normalmente aparecen en animales jóvenes (2). Por otro lado, aunque la presencia (3, 6) y patogenicidad (8, 9) de M. hyosinoviae ha sido claramente demostrada, tampoco tenemos datos de su prevalencia en poliartritis en animales jóvenes. Asimismo hay una carencia de trabajos con Chlamydia, a pesar de reconocerse como agente causal de artritis (14).
Puesto que los Mycoplasmas y Chlamydia son patógenos de difícil aislamiento, las técnicas inmunocitoquímicas son de gran valor para su detección e identificación (1, 11), tal y como ha quedado demostrado en el estudio de Mycoplasmas que nuestro equipo ha llevado a cabo en trabajos previos (7, 16).
En este trabajo, además de determinar microbiológicamente la presencia de los diferentes agentes bacterianos, se estudia la implicación de M. hyosinoviae y Chlamydia mediante técnicas inmunocitoquímicas en problemas articulares clínicos de ganado porcino.
En este trabajo se ha estudiado la etiología de los problemas articulares clínicos de porcino en 222 muestras remitidas al laboratorio y pertenecientes a 72 explotaciones diferentes. El laboratorio recibió líquido articular, hisopos o la articulación de uno o varios animales jovenes. En el estudio bacteriológico se aisló, en alguna de las muestras, Streptococcus suis (28% de las explotaciones), Arcanobacterium pyogenes(21%), Streptococcus spp. (15%), Staphylococcus hyicus (11%), Staphylococcus aureus (7%),Staphylococcus spp. (4%), Haemophilus parasuis (4%), Actinobacillus pleuroneumoniae (3%), yErysipelothrix rhusiophatiae (1%). En 21 explotaciones (29%), todas las muestras remitidas fueron bacteriológicamente negativas. Mediante inmunoperoxidasa indirecta (IPX) no se detectó la presencia de Chlamydia en ninguna de las 13 explotaciones estudiadas mientras, que Mycoplasma hyosinoviae se encontró en 35 (76%) de las 46 explotaciones en que se estudió, aislándose por cultivo en 12 de ellas (21%). Estos resultados demuestran que M. hyosinoviae es el patógeno más frecuente en la poliartritis de animales jovenes.
Material y Métodos
Muestras
Durante los años 1999 y 2000 se recibieron 222 muestras de 72 explotaciones de toda España con problemas articulares clínicos. Cuarenta y cuatro explotaciones eran de cerdo ibérico (149 muestras) criados en condiciones semiextensivas, y el resto de razas comerciales. Las muestras remitidas al laboratorio fueron: líquido articular, hisopos articulares o articulaciones enteras del animal, a partir de las cuales se extrajo en el laboratorio el líquido articular o se tomaron hisopos de las zonas articulares lesionadas. El número de muestras recibidas de cada explotación osciló entre una y seis.
En todas las muestras se realizó un cultivo bacteriológico. El diagnóstico de M. hyosinoviae se llevó a cabo en 46 explotaciones y el de Chlamydia spp en 13, siempre a petición de los veterinarios.
Microbiología
Todas las muestras recibidas se inocularon en Agar sangre de cordero, Agar MacConkey y Agar Chocolate (Oxoid). Las placas se incubaron aerobicamente a 37ºC y se leyeron a las 24 y 48 horas de incubación. Las colonias bacterianas se subcultivaron e identificaron utilizando los procedimientos bacteriológicos convencionales (4).
Para el aislamiento de los Mycoplasmas, las muestras se inocularon en caldo Friis y en el medio de Hayflick´s suplementado con acetato de talio 200mg/ml, penicilina 100 UI/ml, suero de caballo (10% v/v) y suero porcino (10% v/v). Las muestras se incubaron a 37ºC durante 7 días en caldo y se subcultivaron en los mismos medios con agar. Las colonias se subcultivaron e identificaron utilizando los procedimientos convencionales (4).
Inmunocitoquímica
Para el estudio inmunocitoquímico se separaron las células del líquido articular y de los hisopos mediante digestión enzimática con tripsina (T-4549 Sigma) al 0,1% en PBS. Las suspensiones celulares obtenidas se lavaron tres veces mediante centrifugación a 1000g durante 5 minutos en PBS y se ajustaron a 5-6 x 105 cells/ml. Diez µl de esa suspensión celular se transfirieron a un porta multiesferas, que se fijo durante 5 minutos a -20º C (90% acetona; 3% H2O2, 7% Distilled water) y se postfijo en BSA 0,5% durante un minuto a 4ºC.
A cada pocillo se le añadieron 10 µl de un antisuero (Mab C5-C8 Chlamydia especie; Argene, Biosoft 18-114, ó anti-M. hyosinoviae obtenido en conejo; PHLS Aarthus collection) a una concentración final de 10 a 100 µg/ml, que se incubó durante una hora en cámara húmeda a 37ºC. Con cada muestra se utilizó un control negativo que incluía diluyente en vez de una antisuero específico. Como segundos anticuerpos se añadieron 10 µl monoclonal anti mouse IgG Fab specific (Sigma A-2304) o de monoclonal anti rabbit IgG (Sigma A-1949) conjugados con peroxidasa, durante 1 hora en cámara húmeda a 37ºC.
Los inmunocomplejos resultantes se detectaron con 9 amino-3 ethyl carbazole (AEC, Sigma A-6926), dimethylformamide (DMF, Sigma D-4254), H2O2 in buffer acetate 50 mM, pH 5, aplicado durante 10 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. La reacción se detuvo con agua destilada y fue teñida con hematoxilina de Mayer (Sigma MHS-16) como colorante de contraste. Los portas se montaron con glycerol vinyl alcohol (GVA, Zymed 00-8000) y se leyeron en un microscopio de campo claro a 1000x.
Resultados y Discusión
En la Tabla 1 se observa que en el 71% de las explotaciones (51 de 72) se encontró al menos un agente bacteriano causante de la poliartritis, mientras que en el 29% restante (21 de 72) no se aislaron bacterias. La presencia de M. hyosinoviae se detectó mediante Inmunoperoxidasa indirecta (IPX) en el 76% de las explotaciones estudiadas (35 de 46) pero solo se aisló mediante cultivo en 12 explotaciones (21%). Estas 12 explotaciones también fueron positivas por IPX. Por otra parte, Chlamydia no se ha encontrado en ninguna de las 13 explotaciones estudiadas, lo que concuerda con el trabajo de Turner (16), a pesar de ser un patógeno frecuente en problemas articulares de otras especies (13) y de haber sido descrito como tal en ganado porcino (14).
Tabla 1: Resultados de cultivo y de IPX obtenidos en problemas articulares porcinos.
| Bacterias/Virus | Explotaciones estudiadas | Cultivo | % | IPX | % |
| Streptococcus suis | 72 | 20 | 28 | ||
| Streptococcus spp. | 72 | 11 | 15 | ||
| Staphylococcus aureus | 72 | 5 | 7 | ||
| Staphylococcus hyicus | 72 | 8 | 11 | ||
| Staphylococcus spp. | 72 | 3 | 4 | ||
| Haemophilus parasuis | 72 | 3 | 4 | ||
| Actinomyces pyogenes | 72 | 15 | 21 | ||
| Actinobacillus pleuropneumoniae | 72 | 2 | 3 | ||
| Erysipelothrix rhusiopathiae | 72 | 1 | 1 | ||
| Sin crecimiento | 72 | 21 | 29 | ||
| Mycoplasma hyosinoviae | 46 | 12 | 26 | 35 | 76 |
| Chlamydia spp. | 13 | 0 | 0 |
El porcentaje de casos en los que no hay aislamiento bacteriano es muy similar al encontrado por otros autores en animales jovenes (2), aunque es muy inferior al encontrado en trabajos que estudian causas de poliartritis en animales de matadero (3, 10) lo que según Buttenschon y cols. (3) se debe a la capacidad de los agentes bacterianos de mantener el proceso inflamatorio de forma crónica con un número muy bajo de bacterias viables o simplemente por la presencia de sus estructuras antigénicas. Sin embargo, de las 21 explotaciones en las que no se aisló ningún agente bacteriano, 15 resultaron positivas a M. hyosinoviaemediante IPX. De estas 15, en 4 se consiguió además el aislamiento del Mycoplasma mediante cultivo. Teniendo esto en cuenta, el porcentaje de casos que quedan sin diagnóstico disminuye notablemente.
Las diferencias encontradas entre los resultados de IPX y del cultivo de M. hyosinoviae se explican fácilmente por la mayor sensibilidad de la IPX, capaz de detectar los antígenos a pesar de que el patógeno no sea viable (7, 16). Además, cuando trabajamos con pequeños volúmenes como es el caso del líquido articular o hisopos, los Mycoplasmas están sometidos a un mayor estrés medioambiental, y su viabilidad forzosamente decrece. Aún así, el porcentaje de aislamiento por cultivo es análogo al de otros trabajos en muestras articulares (3, 6), aunque muy inferior al citado por Frris y cols. (5) en tonsilas, donde se ha demostrado que M. hyosinoviae permanece en estado latente en una gran proporción de animales que actúan como portadores, lo cual puede explicar la gran prevalencia de este agente en la poliartritis. Hasta ahora, el método directo más sensible para el diagnóstico de M. hyosinoviae era el cultivo, sin embargo, la IPX puede ser una técnica más sensible y rápida que el cultivo. Además, hasta el momento, los intentos para desarrollar técnicas más sensibles como el ELISA no han dado buenos resultados (6).
Las diferentes bacterias aisladas en este estudio en una o varias de las muestras de las distintas explotaciones quedan reflejadas en la Tabla 1. La capacidad de muchos de estos agentes como S. suis, Streptococcus spp.,A. pyogenes, S. hyicus, S. aureus y H. parasuis para producir poliartritis ha sido descrita en numerosas ocasiones (2, 13, 14), y los porcentajes de infección encontrados por distintos autores no varían mucho (2, 10). No obstante, es posible encontrar diferencias dependiendo de la prevalencia de los distintos agentes según regiones o países, así como del momento de producción y la edad de los animales afectados.
En nuestro estudio, A. pleuroneumoniae tipo I (NAD dependiente) aparece como causa de poliartritis en el 3% de las explotaciones, en las que se encontró como único agente patógeno. Para Jensen y cols (12) la artritis es una lesión inusual en las infecciones por esta bacteria, pero nuestros resultados confirman que a pesar de no ser muy frecuente, el aislamiento de A. pleuroneumonie debe tenerse en cuenta en estos procesos, máxime cuando necesita condiciones de aislamiento específicas.
En el caso de E. rhusiopathiae, el porcentaje de aislamientos difiere notablemente del encontrado por otros autores (3, 10, 16) para los que este agente es el patógeno bacteriano más prevalente en procesos artríticos. Sin embargo, todos estos trabajos estudian procesos crónicos responsables de decomisos en matadero, mientras que nuestros datos se refieren a poliartritis agudas y clínicas de animales jovenes, en las que el papel que juegan otros agentes es mucho más importante que el de E. rhusiopathiae.
Nuestros resultados confirman una elevada frecuencia de M. hyosinoviae, mayor que la detectada hasta el momento mediante cultivo, además de la importancia de S. suis, Streptococcus spp., A. pyogenes y H. parasuis en problemas articulares y los resultados de Hill y cols. (2) respecto a S. hyicus y S. aureus. Se reconoce la importancia de A. pleuroneumoniae en estos procesos y se cuestiona la creencia generalizada entre ganaderos y veterinarios de que la mayoría de las artritis están asociadas con S. suis o E. rhusiopathiae.
Estos resultados confirman la gran variabilidad etiológica de las artritis clínicas, y la necesidad de realizar un diagnóstico previo en los problemas articulares dada la diferencia en los tratamientos a realizar según el patógeno encontrado.
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Fuente: Ana Fernández, PhD, Elena Gracia, PhD, Iñaki Albizu DVM, Rafael Baselga, PhD & Razas Porcinas.
