El Síndrome de Estrés Porcino (SEP) es una enfermedad hereditaria causada por una mutación puntual (C T) en el gen que codifica para el receptor de la ryanodina (CRC1).
El SEP genera importantes pérdidas económicas en la industria porcina debido a muerte súbita de los cerdos y/o disminución en la calidad de la carne. Los marcadores moleculares de ADN constituyen un método seguro para la determinación genotípica de dicha mutación. En el presente trabajo, se estudio la frecuencia alélica de esta mutación mediante PCR-RFLP en un total de 64 cerdos de diferentes razas (cerdos criollos Pampa Rocha, híbridos comerciales, Landrace, Large White y Duroc).
De estos el 48.43% presentó genotipo homocigota normal (NN), el 40.62% presentaron un genotipo heterocigota portador de la mutación (Nn) y un 10.93% presentaron un genotipo homocigota recesivo afectados (nn). Este es el primer trabajo donde se determina en Uruguay por técnicas moleculares:
- Presencia de individuos portadores, Nn (razas Landrace, Large White e híbridos comerciales).
- Presencia de cerdos afectados, nn (raza Landrace e híbridos comerciales).
- Ausencia del alelo n en cerdos Pampa Rocha, en la muestra poblacional analizada.
El Síndrome de Estrés Porcino (SEP) es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva causada por una mutación puntual (C T) en el gen que codifica para el receptor de la ryanodina (CRC1). Esta sustitución provoca un cambio aminoací- dico (arginina’!cisteína) en dicha proteí- na la cual funciona como canal de calcio en el retículo sarcoplásmico (Fuji y col., 1991).
El gen CRC1 se encuentra localizado en el par autosómico 6 presentando dos variantes alélicas asociadas al SEP. El alelo normal es dominante sobre el alelo mutado identificándose al genotipo homocigota dominante con la nomenclatura NN (individuos normales), genotipo heterocigota, Nn (portadores de la mutación) y genotipo homocigota recesivo, nn (individuos susceptibles al SEP) (Bonelli y Schifferli, 2001).
La frecuencia de la mutación varía dependiendo de las razas, siendo alta en Pietrain (hasta 97% del alelo mutado), media en Landrace (35%) y media a baja en Large White (19%) (Riojas-Valdés y col., 2005).
La mutación provoca una apertura del canal de calcio impidiendo su cierre (Riojas-Valdés y col., 2005). Se produce así un aumento en la concentración de calcio citoplasmático en el miocito, incrementándose el metabolismo aeróbico, la glucogenólisis y la glucólisis, agotando el ATP, la glucosa y el oxígeno. Esto genera un exceso de dióxido de carbono, ácido láctico, potasio y calor en la sangre, además de un desorden en el equilibrio de iones intra y extracelular y un aumento en la cantidad de agua en la célula. La asociación entre la respuesta al estrés fisiológico, con hipercalcemia, produce como consecuencia final el paro cardíaco del cerdo.
El estado de contracción permanente de la célula muscular provoca hipertrofia muscular, lo cual produce el aumento del desarrollo muscular de la canal (Reiner, 1993). La canal de los cerdos homocigotos recesivos manifiesta un disminución rápida e importante del pH post mortem como consecuencia del incremento del metabolismo causado por el estrés (transporte, faena, cópula, calor excesivo, etc.) (Pommier y col., 1998).
De esta manera, el SEP genera importantes pérdidas económicas en la industria porcina debido a la muerte súbita de los cerdos susceptibles al estrés y a una disminución en la calidad de la carne (carnes pálidas, exudativas y blandas) (Leach y col., 1996). Por otro lado se ha visto la ventaja del efecto gen sobre la producción y diversos autores encuentran que los cerdos Nn presentan una mejor conversión y ganancia diaria de peso frente a los NN (Puentes Martínez, y Peréz Ede, 2007).
Los marcadores moleculares de ADN constituyen un método seguro para la determinación genotípica de portadores de patologías hereditarias causadas por mutaciones puntuales (Bonelli y Schifferli, 2001). Uno de los métodos empleados en la determinación de la mutación es la técnica de PCR y RFLP (polimorfismo en el largo de los fragmentos de restricción).
Este consiste en la amplificación por PCR de una secuencia del gen donde se encuentra la mutación mediante la utilización de oligonucleótidos específicos con una posterior digestión de dicho fragmento con enzimas de restricción (ER) (Bonelli y Schifferli, 2001). Hernández y col. (2008) mediante PCRRFLP, amplifican un fragmento de 659pb del gen CRC1 que incluye a la mutación y mediante cortes con la enzima Alw21I identifican cerdos portadores genotipo, Nn (fragmentos de 524, 358, 166 y 135pb), cerdos normales, genotipo NN (fragmentos de 524 y 135 pb) y cerdos enfermos genotipo nn (fragmentos 358,166 y 135pb).
En nuestro país se identifica por primera vez la mutación mediante técnicas con marcadores moleculares por Montenegro y col. (2009). El objetivo de este trabajo fue realizar el estudio de las frecuencias alélicas para el polimorfismo mencionado utilizando la técnica de PCRRFLP en una muestra de cerdos pertenecientes a la raza local Pampa Rocha (de interés a nivel de conservación de recursos zoogenéticos) y razas de importancia comercial para nuestro País (Large White, Landrace, Duroc e híbridos).
Materiales y Métodos
Se procedió a la extracción de ADN partir de 5 mL sangre periférica de 64 cerdos de diferentes razas:
- 28 híbridos.
- 14 Pampa Rocha.
- 14 Landrace.
- 5 Large White.
- 3 Duroc.
Se entiende por híbridos a las cruzas estandarizadas para venta comercial. Dentro de los híbridos estudiados se incluyen cerdos cruza de Duroc x Pampa Rocha, Landrace x Large White, y Pietrain x Large White. Los cerdos muestreados pertenecen a diferentes establecimientos:
- Unidad de Producción de Cerdos del Centro Regional Sur (Facultad de Agronomía-UdelaR).
- Servicio Veterinario de Remonta del Campo Militar Nº1 (localidad los Cerrillos).
- Empresas de chacinados.
En el aislamiento de ADN se empleó un kit de extracción (AxyPrep, Axygen).
Para la técnica de PCR se utilizaron un par de oligonucleótidos que flanquean la secuencia de 659pb donde se encuentra la mutación: F-CRC1 5’-TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA-3’ y R-CRC2 3’-ATT CACCGG AGT GGA GTC TCT GAG-5’ (Villareal y col., 2005). Para dicha técnica se optimizó un programa de desnaturalización inicial de 94 ºC/5 minutos, seguido de 30 ciclos con desnaturalización a 94 ºC/1 minuto, hibridización a 58 ºC/1 minuto y extensión a 72 ºC/1 minuto, con un programa de extensión final a 72 ºC/5 minutos. Para aumentar la especificidad de la reacción de PCR se utilizó DMSO (dimetilsulfóxido).
Para la técnica de RFLP, se utilizó 10U de la endonucleasa de restricción Alw21I durante 3 h a 37 ºC, con una posterior inactivación de la enzima a 65 ºC durante 20 minutos y una desnaturalización con proteinasa K, incubándose a 37 ºC durante 1 h (Hernández y col., 2008). Los productos obtenidos se visualizaron en geles de agarosa (2% tinción bromuro de etidio) y minigeles de acrilamida (6 % tinción nitrato de plata). Para el cálculo de las frecuencias alélicas se utilizó el software de diseño público Popgene 32 versión 1.32 (Yeh y col., 2000).
Resultados
En los 64 cerdos se observó una banda de amplificación de tamaño esperado (659 pb) al realizar la PCR. La frecuencia para el alelo N fue de 0.687 y para el alelo n fue de 0.313 de acuerdo al análisis realizado con el software Popgene 32 versión 1.32. Del 100% de los cerdos analizados por PCR-RFLP, el 48.43% presentaron genotipo normal (NN, banda de 524pb), el 40.62% con genotipo heterocigota, portadores de la mutación (Nn, bandas de 524 y 358pb), y el 10.93% con genotipo (nn, banda de 358pb), siendo estos individuos afectados por el SEP. En los Nn y nn aparecen las bandas 166 y 135pb muy tenues mientras que en NN aparece la banda de 135pb.
Estas bandas en general aparecen muy tenues en los geles de acrilamida y no interfieren en la lectura del genotipado de los cerdos (Hernández y col.; 2008).
Discusión
Los individuos más susceptibles encontrados en este estudio, entre portadores y enfermos, son los híbridos y los Landrace mientras que en la raza local Pampa Rocha no se encontraron cerdos portadores ni enfermos. En cerdos híbridos, estudios previos indican una frecuencia de la mutación causante del SEP de un 16%, mientras que en Landrace es de un 35%. En el caso de las razas Large White y Duroc, la frecuencias previas encontradas son de 19 y 15% respectivamente (Riojas-Valdés y col., 2005).
De todas maneras no se pueden hacer inferencias respecto a la prevalencia de la mutación en las diferentes razas debido al bajo nú- mero de cerdos analizados para cada una de las mismas. Se destaca como principal resultado que mediante la técnica de PCR-RFLP, se detectó por primera vez en nuestro país la presencia de la mutación puntual causante del SEP, pudiéndose identificar cerdos portadores y enfermos.
La información generada permitirá eliminar a estos individuos como reproductores, disminuyendo de esta manera la frecuencia de dicha mutación. Debemos tener en cuenta que esta patología hereditaria afecta a la industria porcina (Bonelli y Schifferli, 2001).
Por otro lado existe la tendencia de producir cerdos con menos grasa y más músculo llevando a que los productores seleccionen cerdos heterocigotos (efecto gen asociado a mayor rendimiento de la canal y menos grasa) (Puentes Martínez y Peréz Ede,2007). Sin embargo, el beneficio de la selección realizada a favor de los portadores aún se encuentra en discusión. Esta selección posibilito el aumento de la frecuencia, así como su difusión a través de reproductores seleccionados para esta característica.
La optimización de las técnicas empleadas (PCR-RFLP), podría ser empleada como metodología para el diagnóstico de esta patología hereditaria así mismo como una herramienta para identificar portadores y realizar cruzamientos dirigidos aplicados a mejorar la producción porcina. Por otro lado, resultó interesante el estudio del recurso zoogenético local Pampa Rocha, debido a que se generaron datos que contribuyen con la caracterización genética de la misma, aspecto muy importante a tener en cuenta cuando se quieren realizar estudios para la conservación de una raza.
En un principio se esperaba encontrar cerdos portadores de la mutación o enfermos, debido a que esta raza tendría en sus orígenes sangre de las razas Berkshire y Poland China (Kelly y col., 2004), en esta última la prevalencia de la mutación causante del Síndrome estudiado es de un 80% (Bonelli y Schifferli, 2001). Sin embargo, todos los cerdos Pampa Rocha analizados resultaron normales, no encontrándose hasta el momento individuos portadores o enfermos.
Estos datos resultan de interés, considerando que es una raza local utilizada por pequeños y medianos productores del este de nuestro país (Departamento de Rocha), y que podría ampliarse su uso por otros productores. Este resultado también podía esperarse al tratarse de una raza local, en la cual se supone que ha sido mínima la aplicación de métodos de selección.
Conclusiones
Mediante el uso de técnicas moleculares (PCR y marcadores moleculares) se detectó por primera vez en nuestro país; la presencia de la mutación puntual causante del Síndrome de Estrés Porcino, pudiéndose identificar cerdos portadores y enfermos. La optimización de las técnicas empleadas (PCR-RFLP), podría ser utilizada como metodología para el diagnóstico de esta enfermedad hereditaria contribuyendo a la mejora genética en producción porcina. En la muestra de la raza Pampa Rocha no se detecto el alelo mutante.
Fuente: SMVU & Razas Porcinas.
